Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者成果缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次显露现人体内自身免疫质子化到显露现1型式白血病临床腹泻的成效率在青少年时期就有不错的描绘出，多个人体内自身免疫质子化中性的青少年当中有70%在血清转换后10年内患上白血病，而随访15年的青少年这一平均值减低到84%。相较之下，占临床1型式白血病一半以上的型式1型式白血病的确诊机制还并未取得应有的研究课题。

越来越多的人开始用作分期系统来定义1型式白血病的成效：母体在显露现多种人体内自身免疫质子化时进到第1阶段性，显露现血糖异常时进到第2阶段性，显露现腹泻时进到第3阶段性。一些多发人体内自身免疫质子化中性的母体，在1期和2期，成效较慢，并发展为确诊的1型式白血病。我们以前描绘出了一两组在首次检测到多种人体内自身免疫质子化试样后数10年无白血病的正因如此慢成效者，这两组病症人数少，但特征更加说明。随后，我们发掘出人体内自身肝细胞特异性CD8+T细胞膜质子化在成效平稳的病症当中基本不发挥作用，但在近期确诊和长期发挥作用的白血病病症当中很容易检测到。这可能表明，与成效病症相较，这些病症自身免疫质子化的通气增强。

早期研究课题表明，尽管通气性T细胞膜(Treg)数量正常，但白血病病症发挥作用一些功用缺陷，其当中包括对IL-2的质子化战斗能力增大。此外，白血病病症当中的effectCD4+T细胞膜可能对通气更具抵抗性，表现为effectT细胞膜的诱发移向，自然归因于的Treg和体外归因于的抑止Treg，以及肝细胞随之而来的CD4+T细胞膜当中IL-2质子化移向。本研究课题的目的是描绘出了CD4+通气性T细胞膜(Treg)在一小群正因如此平稳成效者当中的特征，他们的平均年龄为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

方法：BOX研究课题是一项以人群为基础的纵向研究课题，在21岁以下确诊的病症亲属当中检查1型式白血病的危险性环境因素。我们以前描绘出了长期平稳成效者的特征，他们保持稳定多重人体内自身免疫质子化中性超过10年，但并未显露现白血病的临床腹泻，慢性或非开展性自身免疫。随后，10名继续保持稳定无白血病并愿意提供大量血浆试样的平稳成效者归入T和B细胞膜功用分析。在目前的研究课题当中，8名慢成效者(SP两组)，当中位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的人体内自身免疫质子化中性。所有的举例来说都处于1型式白血病成效的1期，尽管一些人随后失去了人体内自身免疫质子化对某些肝细胞的中性质子化，然而，一名病症以前处于2期数6年，但并未显露现临床腹泻，一名病症被诊断为白血病，该人脑72岁，在采集实验试样时，其HbA1c升高到53 mmol/mol(7%)，在数据分析当中对该NADPH开展了单独评估。分离外周血单个核子细胞膜(PBMCs)，采用多参数流式细胞膜术和T细胞膜诱发试验评估NADPH当中Treg的高频率、特异性和功用。用作FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和回归)开展无都由聚类分析，评估Treg特异性。

结果：与有益NADPH相较，来自慢成效体的无意识CD4+T细胞膜的都由聚类标示出，激光阴的无意识CD4+ Treg高频率减低，与糖皮质激素抑止的TNFR相关受体(GITR)表达出来减低有关。一名HbA1c升高的病症与成效平稳者和匹配的对照两组相较，Treg谱有所不尽相同。功用相比较，与有益NADPH相较，来自平稳成效体的Treg介导的CD4+effectT细胞膜诱发明显受到影响。表现为对effectCD4+T细胞膜CD25和CD134表达出来的诱发减低。

所示1 深入的特异性分析标示出，CD4+Treg亚型式在慢成效路由表当中减低。由FlowSOM生成的Treg室，聚集在来自所有NADPH的光阴CD4+CD45RA -细胞膜上。根据标记物表达出来鉴定显露10个元簇:无意识T细胞膜_1;无意识T cell_2;无意识T cell_3;无意识T cell_4;CD49b无意识T细胞膜;HLA-DR + GITR +无意识T细胞膜;CPUTreg_1;CPUTreg_2;CPUTreg_3;和CPUTreg_4。(a)用作9个不尽相同Treg标记生成的10个元簇的MST。每个路由表代表一个协同(100个协同)，更大的元协同(10个元协同)在路由表两组附近剪裁。每个路由表当中的面包所示透露单个标记的表达出来级别。(b)每个元聚类的热所示，以标示出整体标记表达出来。(c, d)为HD两组(c)和SP两组(d)生成所示，以及FlowSOM识别的每个元簇的基岩。(e-l)相对重元素为每个metacluster装有直通所示(重元素> 0.05%)确定为HD和SP两组:CPUTreg_2 (e),CPUTreg_3 (f),CPUTreg_4 (g), HLA-DR + GITR +无意识T细胞膜(h)、无意识T cell_1(i),无意识T cell_2 (j),无意识T cell_3 (k) n d CD49b无意识T细胞膜(l)。绿色白点代表**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩验。此键适用于所示形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

所示2 用作CITRUS的相比较式证明，Treg高频率的减低是成效平稳的标识。分级介导(a - f)和柑橘分析(g-k)相对SP举例来说和匹配的HD举例来说在CD4+CD45RA−T细胞膜上的差异。(a)特异性CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群体的代表性所示。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3非金属，然后通过HLA-DR和GITR表达出来开展分离，模拟FlowSOM群体。(b) HD(黑点)和SP(布氏)两组以及NADPHSP 606(绿色)当中CD25+ cd127的高频率概述所示。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+介导集合的装有直通所示;(c) HLA-DRloGITR−(CPUTreg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(CPUTreg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(CPUTreg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+CPUT cell)。(g - i)甜菜簇螺旋由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3表达出来数值着色，箭头突显露的簇被识别为SP和HD路由表之间的不尽相同。(j)装有直通所示标示出了在SP(布氏)和HD(灰点)两组当中，CITRUS无意识Treg_3和Treg_4的相对重元素(平均值)。(k)直方所示标示出每个簇的特异性(粉红色)和Treg标记相对表达出来与着重表达出来(红色);上列，CPUTreg_3;下面一行，CPUTreg_4。着重与所有其他簇当中标记的表达出来有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对符号秩验

所示3 与有益献血者相较，成效平稳者无意识treg的GITR减低。每个无意识CD4+T细胞膜元簇(无意识T细胞膜_1;无意识T cell_2;无意识T cell_3;CD49b +无意识T细胞膜;HLA-DR + GITR +无意识T细胞膜;CPUTreg_2;CPUTreg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)检测每个表达出来标记的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)路由表的表达出来热所示(sp606不包括在内)。(c,d)无意识Treg_4元簇当中所有HD(灰色)、所有SP(红色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR表达出来串联，标示出直方所示(c)和概述所示(d)。Wilcoxon配对符号秩和验，p< 0.07(绿色)所有NADPH包括，p< 0.05(红色)NADPHSP 606和匹配的HD不包括在测试当中。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs当中GITR表达出来，从分级介导，从所有HD(灰色)、所有SP(红色)和SP 606(绿色)串联，标示出直方所示(e)和概述所示(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对符号秩验

所示4 来自平稳成效的CD4+ treg细胞膜掌控effectCD4+T细胞膜的战斗能力增大。SP两组用红色的直通和白点透露，HD两组用灰色的直通和白点透露，绿色的直通/白点透露NADPHsp606。用作CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜开展分选。CD4+CD25−(需要的话者)被标记为CFSE, Treg按观察的平均值滴定。用抗CD3 /28微珠激光阴细胞膜，人才3几天后开展流式细胞膜术检测。(a-d)与CD4+需要的话者相对应的treg人才(自体)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD需要的话者人才。(a,b,f) CFSE再生(a,e)和CFSE诱发平均值(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的诱发平均值。用作中性对照(激光阴的响应细胞膜不含treg)计算诱发平均值。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相对测试

所示5 effectCD4+T细胞膜对平稳成效的T细胞膜激光阴的诱发更敏感。SP两组用红色的直通和白点透露，HD两组用灰色的直通和白点透露，绿色的直通/白点透露NADPHsp606。用作CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜开展分选。CD4+CD25−(需要的话者)被cfsel标记，treg按观察的平均值滴定。用抗CD3 /28微珠激光阴细胞膜，人才3几天后开展流式细胞膜术(CD25反染)和细胞膜因子分析。HD Treg与HD、SP或sp606需要的话者共同人才。(a,b) CFSE再生(a)和CFSE诱发百分率(b)。(c,d) CD25诱发百分率(c)和CD134诱发百分率(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共人才当中的表达出来。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相对测试

得出结论：我们得显露的得出结论是，来自平稳成效子的激光阴无意识CD4+Treg在GITR表达出来当中取得了扩展和丰富，特别强调了促使研究课题Treg在1型式白血病风险母体当中的异质性的必要性。

注解显露处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28